วิธีการใช้อัลตราซาวนด์สำหรับการทำลายเซลล์และการสกัด DNA/RNA

วิธีการใช้อัลตราซาวนด์สำหรับการสลายเซลล์และการสกัด DNA/RNA?

อัลตราซาวนด์เป็นเทคโนโลยีที่มีประสิทธิภาพและใช้กันทั่วไปในการสลายเซลล์และการสกัดกรดนิวคลีอิก (DNA/RNA) หลักการสำคัญคือการใช้ผลกระทบจากการเกิดโพรงอากาศและการสั่นสะเทือนทางกลเพื่อทำลายโครงสร้างเซลล์และปล่อยสารภายใน ต่อไปนี้คือคำอธิบายจากกลไกเฉพาะ กระบวนการใช้งาน และข้อควรระวังที่สำคัญ:

I. หลักการและกระบวนการของอัลตราซาวนด์สำหรับการสลายเซลล์
หัวใจสำคัญของการสลายเซลล์คือการทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ (เซลล์สัตว์) หรือผนังเซลล์ + เยื่อหุ้มเซลล์ (พืช แบคทีเรีย เชื้อรา ฯลฯ) เพื่อปล่อยสารภายในเซลล์ (เช่น กรดนิวคลีอิก โปรตีน ออร์แกเนลล์ ฯลฯ) อัลตราซาวนด์ทำสิ่งนี้ได้ผ่านกลไกดังต่อไปนี้:
1. หลักการสำคัญ: ผลกระทบจากการเกิดโพรงอากาศ
อัลตราซาวนด์เป็นคลื่นกลความถี่สูงที่มีความถี่สูงกว่า 20kHz เมื่อใส่หัววัดอัลตราโซนิก (ตัวขยายของเครื่องสลายอัลตราโซนิก) ลงในตัวอย่างของเหลวที่มีเซลล์ จะเกิดการสั่นสะเทือนความถี่สูง (โดยปกติ 15-50kHz) ซึ่งจะทำให้เกิดโพรงอากาศในตัวกลางของเหลว:

การสั่นสะเทือนความถี่สูงทำให้เกิดฟองอากาศขนาดเล็กจำนวนมาก (ฟองอากาศจากการเกิดโพรงอากาศ) ก่อตัวขึ้นในของเหลว ฟองอากาศเหล่านี้ขยายตัวและบีบอัดอย่างรวดเร็วภายใต้การเปลี่ยนแปลงของแรงดัน และในที่สุดก็ระเบิดอย่างรุนแรง (ยุบตัว)
เมื่อฟองอากาศแตกออก พลังงานทันทีมหาศาล (อุณหภูมิสูงเฉพาะที่ แรงดันสูง และคลื่นกระแทกที่รุนแรง) จะถูกปล่อยออกมา และแรงกระแทกที่เกิดขึ้นจะฉีกโครงสร้างเยื่อหุ้มเซลล์ (เยื่อหุ้มเซลล์ ผนังเซลล์) โดยตรงเพื่อให้ได้การแตกตัวของเซลล์
2. ผลเสริม: การสั่นสะเทือนทางกลและแรงเฉือน
การสั่นสะเทือนทางกลความถี่สูงของอัลตราซาวนด์จะสร้างแรงเฉือนและแรงเสียดทานโดยตรงบนเซลล์ ซึ่งช่วยในการทำลายโครงสร้างเซลล์เพิ่มเติม โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเซลล์ที่มีผนังเซลล์หนา (เช่น เชื้อราและเซลล์พืช)
3. กระบวนการแตกตัว (ยกตัวอย่างการดำเนินการทดลอง)
ใส่สารแขวนลอยเซลล์ที่จะทำการรักษา (เช่น ของเหลวเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย สารโฮโมจีเนตเนื้อเยื่อ ฯลฯ) ลงในหลอดปั่นเหวี่ยงหรือบีกเกอร์ ใส่หัววัดอัลตราโซนิก (แตร) และหัววัดต้องจุ่มลงในของเหลวแต่ไม่สัมผัสกับผนังภาชนะ

เปิดเครื่องอัลตราโซนิกและตั้งค่าพารามิเตอร์ (กำลังไฟ เวลา ฯลฯ): การสั่นสะเทือนความถี่สูงสร้างฟองอากาศจากการเกิดโพรงอากาศในของเหลว และแรงกระแทกที่เกิดจากการระเบิดของฟองอากาศจะทำลายโครงสร้างเซลล์โดยตรงและปล่อยสารภายในเซลล์ (รวมถึงกรดนิวคลีอิก โปรตีน เมตาโบไลต์ ฯลฯ)
2. การประยุกต์ใช้อัลตราซาวนด์ในการสกัด DNA/RNA โดยเฉพาะ
ขั้นตอนหลักของการสกัด DNA/RNA ได้แก่: การสลายเซลล์เพื่อปล่อยกรดนิวคลีอิก → การกำจัดสิ่งเจือปน (โปรตีน ไขมัน โพลีแซ็กคาไรด์ ฯลฯ) → การทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิก บทบาทของอัลตราซาวนด์ส่วนใหญ่อยู่ในขั้นตอนแรก - การสลายเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพและการปล่อยกรดนิวคลีอิก สถานการณ์การใช้งานและข้อดีเฉพาะมีดังนี้:
1. ประเภทตัวอย่างที่เหมาะสม
อัลตราซาวนด์เหมาะสำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิกจากตัวอย่างที่หลากหลาย รวมถึง:

เนื้อเยื่อสัตว์ (เช่น ตับ กล้ามเนื้อ): ต้องตัดเป็นชิ้นเล็กๆ ก่อน อัลตราซาวนด์สามารถสลายเซลล์และปล่อยกรดนิวคลีอิกได้อย่างรวดเร็ว;
แบคทีเรีย/เชื้อรา: ผนังเซลล์ค่อนข้างแข็ง วิธีการแบบดั้งเดิม (เช่น การรักษาด้วยไลโซไซม์) ไม่มีประสิทธิภาพ และอัลตราซาวนด์สามารถทำลายผนังเซลล์ผ่านผลกระทบจากการเกิดโพรงอากาศที่แข็งแกร่ง;
เซลล์เพาะเลี้ยง (เซลล์เกาะติดหรือเซลล์แขวนลอย): การแขวนลอยโดยตรงแล้วอัลตราซาวนด์ ไม่จำเป็นต้องมีการเตรียมการเบื้องต้นที่ซับซ้อน;
เนื้อเยื่อพืช: มีเซลลูโลสและเพกติน อัลตราซาวนด์สามารถช่วยในการทำลายผนังเซลล์และปล่อยสารในเซลล์
2. พารามิเตอร์สำคัญในการดำเนินการ (มีผลต่อคุณภาพของกรดนิวคลีอิก)
การรักษาด้วยอัลตราโซนิกต้องควบคุมพารามิเตอร์อย่างเข้มงวดเพื่อหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพของกรดนิวคลีอิกหรือการแตกตัวมากเกินไป (มีผลต่อการทดลองในภายหลัง เช่น PCR การจัดลำดับ ฯลฯ):

กำลังไฟ: โดยปกติ 50-300W (ปรับตามประเภทตัวอย่าง เช่น แบคทีเรียต้องการกำลังไฟที่สูงกว่า) กำลังไฟที่สูงเกินไปจะทำให้กรดนิวคลีอิกถูกตัดสั้นเกินไป และกำลังไฟที่ต่ำเกินไปจะส่งผลให้การแตกตัวไม่เพียงพอ
เวลาทำงาน/ช่วงเวลา: ใช้การรักษาแบบ "พัลส์" (เช่น ทำงาน 30 วินาที + พัก 30 วินาที) เพื่อหลีกเลี่ยงการสร้างความร้อนด้วยอัลตราโซนิกอย่างต่อเนื่องซึ่งนำไปสู่การเสียสภาพของกรดนิวคลีอิก (DNA/RNA เสื่อมสภาพได้ง่ายที่อุณหภูมิสูง)
ระยะเวลาการรักษาทั้งหมด: ขึ้นอยู่กับตัวอย่าง (เช่น 1-3 นาทีสำหรับเซลล์สัตว์ และ 3-5 นาทีสำหรับแบคทีเรีย) การรักษาที่มากเกินไปจะทำให้อนุภาคกรดนิวคลีอิกแตกตัวมากขึ้น
การควบคุมอุณหภูมิ: อ่างน้ำแข็งตลอดกระบวนการ (ตัวอย่างถูกวางบนน้ำแข็ง) เนื่องจากกระบวนการอัลตราโซนิกจะสร้างความร้อน (ผลกระทบจากการเกิดโพรงอากาศมาพร้อมกับอุณหภูมิสูงเฉพาะที่) อุณหภูมิต่ำสามารถยับยั้งกิจกรรมของนิวคลีเอสและปกป้องความเสถียรของกรดนิวคลีอิก

3. ข้อดีและข้อควรระวัง
ข้อดี
ประสิทธิภาพสูง: เร็วกว่าวิธีการแบบดั้งเดิม (เช่น การบด การแช่แข็งและละลายซ้ำ การย่อยด้วยเอนไซม์) (โดยปกติจะเสร็จสิ้นภายในไม่กี่นาที) และการสลายตัวอย่างละเอียดมากขึ้น;
สากล: ใช้ได้กับตัวอย่างหลายประเภท (สัตว์ พืช จุลินทรีย์ ฯลฯ);
ใช้งานง่าย: ไม่จำเป็นต้องใช้สารเคมีที่ซับซ้อน จำเป็นต้องใช้เพียงเครื่องมืออัลตราโซนิกและอุปกรณ์หมุนเหวี่ยงพื้นฐาน
ข้อควรระวัง
หลีกเลี่ยงฟองอากาศ: หากมีฟองอากาศจำนวนมากในตัวอย่าง ประสิทธิภาพของผลกระทบจากการเกิดโพรงอากาศจะลดลง และหัววัดอาจร้อนเกินไป ตรวจสอบให้แน่ใจว่าหัววัดจุ่มลงในของเหลวอย่างสมบูรณ์ (ระดับของเหลวประมาณ 1-2 ซม.);
การยับยั้งนิวคลีเอส: หลังจากการสลายตัว ควรเติมสารละลายไลซิส (รวมถึง EDTA ผงซักฟอก ฯลฯ) ในเวลาเพื่อยับยั้งนิวคลีเอสในเซลล์ (เช่น RNase ที่ย่อยสลาย RNA ได้ง่าย);
ปริมาณตัวอย่าง: ปริมาณการประมวลผลครั้งเดียวไม่ควรใหญ่เกินไป (โดยปกติ ≤5mL) มิฉะนั้น การกระจายพลังงานอัลตราโซนิกจะไม่สม่ำเสมอและผลการสลายตัวจะแตกต่างกันอย่างมาก

สรุป
อัลตราซาวนด์สลายเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพผ่านผลกระทบจากการเกิดโพรงอากาศและการสั่นสะเทือนทางกล โดยให้ "ขั้นตอนการปล่อย" ที่สำคัญสำหรับการสกัด DNA/RNA หัวใจสำคัญคือการปรับกำลังไฟ เวลา และอุณหภูมิให้เหมาะสมเพื่อสลายเซลล์อย่างเต็มที่ในขณะที่เพิ่มการปกป้องความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกให้สูงสุด เทคโนโลยีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในขั้นตอนการประมวลผลเบื้องต้นของการทดลองทางชีววิทยาระดับโมเลกุล (เช่น การโคลนยีน qPCR การวิเคราะห์ทรานสคริปโตม ฯลฯ) และเป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิก